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細胞被污染只能扔掉嗎？還能搶救一下嗎？
更新時間：2023-11-24
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常見的細胞污染分為以下幾類∶
細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有好幾種，分別是細菌污染、支原體污染、黑膠蟲污染、真菌污染、以及細胞交叉污染。他們在細胞培養(yǎng)中污染的特點如下：
一：細菌污染
細菌污染：細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。
一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。
看到這種，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復(fù)沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉素、新霉素（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。
二.支原體污染
特征：最小的微生物，無法通過光學(xué)顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。感染支原體的細胞，在某一時間點碎片突然增多，隨著傳代，細胞狀態(tài)顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細胞房其他細胞。
鑒定方法：PCR法、顯色法、熒光染色法等。
處理方法：若細胞狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
三、黑膠蟲污染
特征：無明確定義，鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細胞狀態(tài)差，黑點和碎片多，布朗運動。通過檢測發(fā)現(xiàn)主要為支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。
處理方式：若細胞狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
四、真菌污染
特征：呈鏈球狀或絲狀。常形成肉眼可見的菌落，培養(yǎng)基顏色無變化或變紫，僅對局部細胞影響較大，其他地方生長正常。會形成孢子，容易污染其他細胞。
處理方法：真菌污染較難除，不建議保留，建議消殺后丟棄。
五、細胞交叉污染
特征：即不同的細胞混雜在一起
鑒定方法：
同種屬：STR鑒定，多等位基因數(shù)大于3個。
（需考慮本身的遺傳背景，如EA.hy 926為融合細胞，本身就包含兩套遺傳信息）
不同種屬：PCR法，對種屬特異性基因進行擴增，不同種屬產(chǎn)物大小不同。
處理方法：建議重新引種。
六、細胞污染的處理
應(yīng)對細胞污染的最好對策是預(yù)防!預(yù)防!再預(yù)防!養(yǎng)細胞要勤快，平時所用到的耗材、器皿等要及時高壓滅菌，滅菌后超過一周未使用也應(yīng)重新滅菌。配制的培養(yǎng)基、胰酶、PBS等最好在一周內(nèi)用完。同時，也應(yīng)每天查看一下細胞狀態(tài)。在細胞房內(nèi)應(yīng)盡量少地走動，盡量少地說話，若咳嗽或噴嚏時務(wù)必背向超凈臺。
細胞污染后處理方式是丟棄。當(dāng)個別細胞十分珍貴無法丟棄時可盡力“急救"一下。
那么如何急救呢?
1，判斷污染源。一旦發(fā)現(xiàn)細胞有污染的跡象或已污染，立即判斷可能的污染源︰有無操作不當(dāng)?培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常?
2，及時處理。若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用;若無法確定則新配培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。
現(xiàn)以貼壁細胞為例向大家介紹下細菌污染時如何“急救"∶
1)，立即棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基，以PBS潤洗2~3次，加入胰酶處理至細胞形態(tài)略有改變但未脫離容器時棄去胰酶，加入PBS輕輕潤洗1遍;
2)，加入20×雙抗，浸泡細胞3~5min，棄去雙抗;
3)，加入新鮮的培養(yǎng)基(含10×雙抗)培養(yǎng)12 h;
4)，12 h棄去培養(yǎng)基以PBS潤洗2~3遍后加入培養(yǎng)基(含10×雙抗);
5)，傳代時以較小轉(zhuǎn)速離心(如平時以1000 r/min離心，則可降為800~900r/min離心)，仍以含10×雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng);
6)，若第二代后鏡下找不到細菌，則第三代起可正常培養(yǎng)。正常培養(yǎng)48 h后無反彈則可認為污染已清除。
若為霉菌污染，在以PBS潤洗2~3遍后換液，無需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48 h后污染未再次出現(xiàn)即可。
若為真菌污染，在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B(兩性霉素B有細胞毒性，不推薦使用)，也可加入300 ug/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150 ug/mL培養(yǎng)2~3代。
若懷疑支原體污染，則可進行PCR檢測或直接使用支原體清除試劑(如∶某恒生物)。也可購買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺內(nèi)打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20 ug/mL濃度2代后改用10 ug/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。
附∶常用抗生素劑量和抗菌范圍
